リード C
73. 遺伝子組換え 次の実験について, 以下の問いに答えよ。
実験 ヒトのDNA
に特定の塩基配列
を認識して切断する
酵素Aを作用させ物
て遺伝子Xを含む
DNA 断片を切り出し
た。また,同じ酵素
でブラスミドに切れ
目を入れた。両者を
寒天培地
amp
IPTG
X-Gal
観察された
白色
白色
コロニー
のみ
白色と
のみ
青色
表1 実験で用いた寒天培地と観察結果(+あり -なし)
生
公し切断点をつなぐ酵素Bをはたらかせた。この混合液を大腸菌に取りこませ
後その溶液を寒天培地(a), (b) ,(c))で培養すると,表1のようになった。
ここで使用したプラスミドはamp* と lacZ という遺図1
伝子をもつ(図 1)。 amp は抗生物質アンピシリン(amp)
を分解する酵素の遺伝子で,常に転写されており,こ
れがはたらくとアンピシリン耐性になる。lacZ は B
ガラクトシダーゼという酵素の遺伝子で,この酵素は
XGal という基質を分解し青色の色素を生成して大腸菌
コロニーを青くする。またこのプラスミドの lacZ の遺 0:オペレーター
ANO本
物
(イ)
lacZ
転写方向
0
| amp?
P
プラスミド
P:プロモーター
伝子発現は IPTG(イソプロピル-B-チオガラクトピラ
ノシド)という物質により誘導される(表1)。酵素Aにより切断されるプラスミドの位
置は図に示すようにlacZ内部にあるため,ここに DNA 断片が挿入されると lacZが分
断され,正常なβガラクトシダーゼを合成できなくなる。なお, 今回使用した大腸菌
は自身の lacZ 遺伝子はもたないものとする。
(1)下線部ア)のような酵素を一般的に何というか, その名称を答えよ。
(2) 下線部イ)のような酵素を一般的に何というか, その名称を答えよ。
(3) プラスミドのように外来性の遺伝子を運搬するはたらきをもち, 導入された細胞の
中で増殖することのできる DNAを一般に何というか。 その名称を答えよ。
表1で示す。 寒天培地(a)で見られる白いコロニーと寒天培地(c)で見られる白色と青
色のコロニーはそれぞれどのような大腸菌由来のコロニーであると考えられるか。
最も適切なものを(ア)~(オ)の中からそれぞれ1つ選び, 記号で答えよ。
(ア) プラスミドを受け取った大腸菌
(イ)プラスミドを受け取っていない大腸菌
(ウ)遺伝子Xのみを受け取った大腸菌
(エ)遺伝子Xが挿入されたプラスミドを受け取った大腸菌
(オ)何も挿入されていないプラスミドをもった大腸菌
『:酵素A切断部位
[13 長崎大改)
VICmO
無はわからない。よって, 寒天培地(a)で見られるコロニーは(アのプラスミドを受け
取った大腸菌である。寒天培地(c)には, X.Gal と IPTG が添加されているため,()
80 リードa生物」
ーリードa生物 81
文が挿入されたプラスミドを受け取った大腸菌は, βガラクトシダーギ
の遺いるきず白色のコロニーをつくる。 また,(れの何も挿入されていないプラスミ
72
ドを受け取った大腸菌はβガラクトシダーゼによって X.Gal を分解できるので, 青
AMR
5500
1500 1000
2000
色のコロニーをつくる。
右図のように, DNA【断片の左端をX
右端をYと仮定する。 ECORI で処理すると、
この DNA は1か所(右図Eの部位)で切断
され,2500 塩基対と 7500 塩基対の2つの断片ができる。
次に, ECORI と BamHI の両方を使った
場合,1000, 1500, 2000, 5500 の4つの
断片ができる。よって, BamHI は XE を
1000 と 1500 に, EYを 2000 と 5500 に切
断することがわかる。ここで、右図のよ
うに,BamHI がXE を切断する部位を B1,
EY を切断する部位を B2 とする。
BamHI のみで DNA を切断する場合は,
断片は,1500, 3000, 5500 の 3つである
から,右図のように, BIE = 1500 とする
と, EB2 = 2000 または5500 であることか
「解説」
て な
2500
7500
TbO
(1) ア プライマー (イ) 相補 () DNA ポリメラーゼ
ヌクレオチド(ヌクレオシド三リン酸)
(3) 切れる結合の名称…水素結合, 結合に関与する部分の名称…塩基
大
74
B1 はXE を1000 と
|1500に切断する
B2 はEY を2000と
5500に切断する
(2) A
生
B1
B2
(1) PCR を行う際には,増幅するもとの DNA,プライマー, DNA ボリメラーゼ, 4
種類のヌクレオシド三リン酸が必要である。
(エ) ヌクレオチドは,糖と塩基が結合したヌクレオシドにリン酸が結合したもので
あり,リン酸が3つ結合したヌクレオシド三リン酸もヌクレオチドの一種である。
(2), (3) PCR の手順としては, まず 95℃に温度を上げて DNA の相補的な塩基とうし
の水素結合を切って,1本鎖にする。次に,50~60°℃にすると,プライマーが1
太第DNA の相補的な塩基配列の部位に結合する。その後,約72°℃にすると DNA
#リメラーゼがプライマーにつなげて DNA 鎖を伸長する。なお, このときに用い
る DNA ポリメラーゼは, 好熱性細菌(深海の熱水噴出孔付近などの高温環境に生
息する細菌)のもので,高温下でも失活しない。
物
生
2500
解説
7500
物
B1E=1500 の場合
0
2000
X B1
) B2
1000 1500
5500
ト ら B1B2 = 3500 または 7000 となり,実
験結果と矛盾する。
会却
AMR BIE = 1000 と すると, EB2 = 2000 の
B1E=1000 の場合
場合に B1B2 = 3000, B2Y = 5500となり,
実験結果と同じになる。
なお,解答の図は,左右逆でも正解である。
X
B1
B2
1500 1000
2000
75
(1)不可能である。
5500
(2) ウ
(3) TCGACCGT
(1)メチオニンとトリプトファンのコドンはそれぞれ AUG, UGGの1種類ずつである。
しかし、これら以外のアミノ酸は2種類以上のコドンに対応している。 例えば, ア
ルギニンは,対応するコドンが6種類(CGU, CGC, CGA, CGG, AGA, AGG)
存在する。したがって, アミノ酸配列から1種類の塩基配列を特定することはでき
解説
73
(3)ベクター
(1) 制限酵素
(4) (a) 白…ア (C) 白…工, 青…オ
(2) DNA リガーゼ
解説
(1) 制限酵素は,細菌がもつ酵素で, 細胞内へ侵入するウイルスの DNA に見られる
特異的な塩基配列を切断し, ウイルスの増殖を制限している。特定の塩基配列の部
分でDNAを切断するはたらきをもち,切断する塩基配列は酵素の種類により異なる。
(4) コロニー形成とそのコロニーの色の2点に着目して考えるとよい。アンピシリフ
を分解する酵素の遺伝子(ampl)をもつプラスミドを取りこんだ大腸菌は, アンピ
シリンを含む培地でコロニーをつくる。次に lacZを含むプラスミドを取りこんだ
大腸菌は,培地中にX-Gal と IPTG が存在すれば、 X-Gal を分解して青色のコロー
をつくる。しかし, lacZ 遺伝子中にヒトの遺伝子Xが組みこまれたプラスミト
取りこんだ場合は, lacZ が分断されているため, X-Gal と IPTG の存在の有無にが
かわらず大腸菌は白色のコロニーとなる。ここで選択肢のうち,(イ)は amp" & "。
ないので,アンピビシリンを添加した培地である(a), (b), (c)ではコロニーをつくること
ができないため解答として不適である。また,プラスミドを受け取らず,遺伝子X
ない。
のチ
(2)この DNA の塩基配列の決定法をサンガ法とい A 。。
う。問題文中の d'A, d'G, d'C, d'T は通常の dA,
dG, dC, dT のヌクレオチド(デオキシリボヌク
レオシド三リン酸)の3'の OH 基がH基になった
特殊なヌクレオチド(ジデオキシリボヌクレオシ
ド三リン酸)である。この特殊なヌクレオチドで
は3'の OH 基がないため,次のヌクレオチドが
結合できず,そこで DNA合成が止まる。通常の
ヌクレオチドを入れた反応液中に少量の d'Aを加
えると、dA と競い合いながら合成中の DNA鎖に取りこまれていく。鋳型鎖の塩
基がTのところで dA が取りこまれると DNA合成は進行するが, dAが取りこま
れるとそこでDNA 合成が停止する。したがって,どの段階でd'Aが取りこまれる
かによって、いろいろな長さの新生 DNA 鎖が合成される。
d'A の濃度が大きいと d'Aが合成中の DNA 鎖に取りこまれる確率が高くなるの
-O-O-CH
塩基(
デオキシ
リポース
リン酸
Y3
OH
H
O-O-O-CH
塩基(
ジテオキシ
りボース
H
次のリン酸が
結合できない
H
Y
H
のみを受け取ることはないので,(ウ)のような大腸菌は存在しない。
寒天培地(a)のコロニーは amp® をもつが,培地中に IPTG が含まれていないため、
lacZ の遺伝子発現が誘導されず, X-Gal を分解できないため,遺伝子Xの挿入の有
回答ありがとうございます！
おそらく理解できました！